Transferts horizontaux et complexification des génomes

Les bactéries, organismes unicellulaire procaryotes, sont faciles à élever en laboratoire et ont donc fait l’objet de nombreuses recherches en génétique qui ont abouti à de grandes avancées médicales.   

Les transferts horizontaux ont été décrits pour la première fois en 1928 chez les bactéries par Griffith.   

Fred Griffith travaillait sur des souches de pneumocoques :  

On sait aujourd’hui que cette différence entre les deux souches est due à une mutation chez la bactérie R touchant le gène codant l’enzyme responsable de la synthèse de la capsule.

La souche S est mortelle pour la souris lorsqu’elle lui est injectée alors qu’au contraire la souche R ne présentant pas de capsule n’est pas nocive pour la souris.

Pour ce faire Griffith chauffa des bactéries de souche S de manière à les tuer mais sans détruire la capsule. L’injection de bactéries S tuées par la chaleur ne provoqua pas la mort des souris. Il en conclut que la capsule n’était pas responsable de la maladie mais que la bactérie de souche S possédait un caractère infectieux que la bactérie de souche R ne possédait pas.

Il décida ensuite d’injecter conjointement des bactéries S chauffées mélangées à des bactéries R vivantes. Cette fois les souris moururent. Il en conclut que les bactéries R au contact des restes de bactéries tuées avaient acquis le caractère pathogène qu’elles ne possédaient pas précédemment. Elles avaient donc récupéré un facteur responsable de leur pathogénicité. 

Il a nommé ce phénomène « transformation bactérienne ». Il restait à découvrir la nature de ce facteur.

Dans les années 40, trois chercheurs, Avery, MacLeod (des canadiens) et McCarty (un américain), ont démontré que la substance transformante qui passait des bactéries S mortes aux bactéries R vivantes n’était pas de nature protéique comme la communauté scientifique de l’époque le pensait mais plutôt de nature nucléique, c’est-à-dire de l’ADN.

Ils reprirent la dernière expérience de Griffith avec une légère variante : les bactéries S mortes avaient été broyées au blender puis traitées avec une enzyme digestive avant de les mélanger aux bactéries R vivantes.

Afin de déterminer la nature du facteur, ils réalisèrent deux essais de transformation bactérienne en ajoutant un enzyme destinée à détruire le facteur transformant impliqué dans la transformation des bactéries R.   

Si le facteur était de nature protéique, alors les bactéries du premier essai ne devaient pas devenir pathogènes. Si le facteur était de nature nucléique, alors les bactéries du deuxième essai ne devaient pas devenir pathogènes.  

Les résultats étaient éloquents :

Pour la première fois, il avait été prouvé que la molécule d’ADN était capable de véhiculer une information.  

C’est Joshua Lederberg, généticien et microbiologiste américain, qui en étudiant la reproduction de la bactérie Escherichia coli, découvrit en 1947 que les bactéries d’une même espèce pouvaient échanger des gènes sans reproduction selon un mécanisme appelé « conjugaison bactérienne ». Cette découverte lui valut de partager en 1900 le prix Nobel de médecine.

Il réalisa cette découverte en travaillant sur 2 mutants d’Escherichia coli : 

Il réalisa deux cultures témoin en boîte de pétri sur un milieu minimum ne contenant aucun des 6 acides aminés : une boîte de culture ne possédant que la souche A et une boîte de culture ne possédant que la souche B. Ainsi en théorie, aucune des 2 souches de bactéries ne devrait pouvoir survivre sur ce milieu. Il mélangea dans un milieu liquide les deux souches mutantes puis étala la culture sur ce milieu gélosé minimum dans une troisième boite de pétri. 

Il constata une semaine plus tard que les témoins ne présentaient aucune population bactérienne alors que la culture issue du mélange des deux souches présentait des colonies bactériennes pour chacune des 2 souches.

Il en conclut que les bactéries de la souche A avaient pu récupérer les gènes permettant la synthèse de la biotine, de la phénylalanine et de la cystéine présents chez la souche B. Inversement les bactéries de la souche B avaient récupéré les gènes permettant la synthèse de la thréonine, leucine et thiamine que possèdent les bactéries de la souche A. 

Il y avait donc eu des échanges de gènes entre des bactéries vivantes par contact les unes aux autres. Ce fut la découverte du mécanisme de « conjugaison bactérienne ». Cette découverte lui valut de partager en 1900 le prix Nobel de médecine.

En 1952, Norton ZINDER et Joshua LEDERBERG tentent d'obtenir des bactéries recombinantes par conjugaison entre deux souches de Salmonella typhimurium :  

Ils espéraient obtenir des recombinants « LA22 his+ trp+ » par conjugaison. Ils ont réalisé plusieurs techniques de culture : soit sur boite de pétri soit dans un tube en U.

Ils avaient remarqué que le taux de recombinants « LA 22 his+ trp+ » n’était pas modifié quand ils installaient dans la courbure du tube en U, un filtre empêchant le contact entre les bactéries mais laissant circuler le liquide de culture. Si la recombinaison s’effectuait ce n’était donc pas par conjugaison. Il fallait trouver un vecteur capable de transporter de l’ADN d’une bactérie à une autre.   

Esther Lederberg, l’épouse de Joshua, elle aussi microbiologiste, avait quelques temps auparavant, mis en évidence l’existence d’un bactériophage, un virus spécialisé dans l’infection des cellules bactériennes et qu’elle avait nommé « phage lambda ».

Le transfert de gènes est un mécanisme beaucoup plus courant qu’on ne le pense. On en retrouve des traces aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes. En modifiant les génomes, il les complexifie et a même permis des avancées évolutives majeures.

Les algues du genre Porphyra constituent un élément de base dans la conception des sushis, aliment très prisé par les Japonais. D’après les écrits, cette algue est consommée depuis de nombreuses générations par les japonais.

Les sushis étant consommés crus, l’hypothèse a été faite que des bactéries marines Zobellia galactanivorans aient été ingérées vivantes puis digérées ce qui aurait ainsi libéré leur l’ADN dans l’intestin des japonais consommateurs de sushis. Ainsi les bactéries de leur flore intestinale auraient subi un transfert de gènes et récupéré les séquences codant pour les enzymes digérant les sucres complexes des algues. 

Pour vérifier cette hypothèse, deux équipes de chercheurs travaillant à la station biologique de Roscoff ont comparé les données génomiques de la flore intestinale de 5 individus japonais et de 18 individus nord-américains. En particulier, des gènes codant pour les porphyranases ont été recherchés dans certaines bactéries de la flore intestinale des deux populations, les bactéries Bacteroides plebeius. On précise que dans cette étude, la bactérie marine Zobellia galactanivorans n’est jamais retrouvée dans la flore intestinale des individus.  

La comparaison des séquences trouvées chez des individus japonais avec la séquence du gène de la porphyranase ou celle du gène de l’agarase, montre, quand elles sont présentes, des pourcentages d’identité élevés. Les bactéries Bacteroides plebeius de leur flore intestinale possède donc bien dans leur génome l’une ou l’autre ou les 2 séquences codant pour ces enzymes. 

Les sushis étant consommés crus, il est donc tout à fait envisageable que les bactéries marines aient été ingérées. Cependant comme aucune bactérie marine n’a été retrouvée vivante dans la flore intestinale, le transfert des gènes par conjugaison n’est pas envisageable et seule la transformation reste possible.

Ainsi lors de la digestion, de l’ADN de Zobellia galactanivorans aurait été libéré et aurait transformé les bactéries intestinales. Le microbiote a donc été modifié et comme le génome d’un individu est constitué de son génome propre et d’un génome associé (celui du microbiote), ainsi le génome des japonais a été complexifié.

Ce mécanisme peut expliquer l’apparition de caractères identiques chez plusieurs espèces n’appartenant pas aux mêmes branches évolutives. Il est possible dans l’étude de l’évolution des espèces de retracer les grands événements de transferts horizontaux de gènes.  

La comparaison de séquences moléculaires homologues de plusieurs espèces permet de construire un arbre phylogénétique précisant les liens de parenté entre celles-ci. Plus 2 espèces présentent de similitudes au niveau de la séquence de molécules homologues, plus leurs liens de parenté sont étroits et plus elles partageront un ancêtre commun récent dont elles ont hérité cette molécule.

Quand des espèces situées sur des branches très éloignées présentent un caractère commun, on peut dire qu’il y a pas eu d’héritage commun ni de filiation entre ces espèces : il est donc tout à fait probable qu’un transfert de matériel ait été effectué chez ces différentes espèces.

Sur le document suivant, les gènes A1 et A2 sont orthologues car ils résultent d’un évènement de spéciation. Cependant l’apparition récente du gène A2 chez l’espèce 1, indique qu’il y a eu transfert de ce gène depuis l’espèce 2. Ce gène A2 chez l’espèce 1 est qualifié d’exemplaire « xénologue ».   

Les poissons dont les noms sont écrits en rouge sont détenteurs du gène responsable de la production des lectines.

Ces poissons étant situés sur des branches évolutives différentes, la thèse d’un vecteur viral est dans ce cas largement envisageable. On peut supposer qu’un individu Hareng de l’Atlantique (espèce la plus ancienne) ait acquis cette protéine suite à une mutation puis que le gène de celle-ci ait été transféré aux autres espèces génétiquement éloignées par le biais d’un virus.

Deux techniques exploitent les transferts horizontaux de gènes :

Dans certains cas, l'insertion du transgène se fait par l'intermédiaire d'un vecteur. Les vecteurs les plus connus sont les plasmides et ils peuvent comporter des séquences de régulation, de réplication ou encore des marqueurs de sélection. Les séquences de régulation comportent obligatoirement un promoteur adapté à l'organisme receveur. Les marqueurs de sélection sont généralement des gènes de résistances à des antibiotiques, des herbicides ou des pesticides.

L'introduction du transgène, ou du vecteur dans le génome de la cellule, peut se faire par perméabilisation des membranes, par un procédé mécanique (projection de microbilles de tungstène ou d'or portant le plasmide), ou encore par un vecteur biologique (une bactérie, Agrobacterium tumefaciens pour la transformation des plantes ou un phage pour la transformation des bactéries). Il est également possible d'introduire la construction génique directement, par micro-injection dans la cellule.

Ce mécanisme s’apparente à la transformation chez les bactéries. Cependant vu que cette action modifie fortement le phénotype des cellules eucaryotes animales on utilisera plutôt le terme de « transfection ».

Les applications de la transgénèse aujourd’hui sont essentiellement médicales.   

Pour introduire un gène dans un plasmide, et donc dans une molécule d’ADN, il faut utiliser une enzyme dite « de restriction ». Cette dernière est capable de couper l’ADN au niveau d’une séquence de nucléotides caractéristique appelée « site de restriction ». L’enzyme choisie ici est l’enzyme BamH I dont le site de restriction se situe au sein du gène T.   

Dans un tube à essais, on introduit une solution contenant des plasmides originaux, une solution d’enzymes de restriction BamH I, une solution contenant le gène de proinsuline et une solution d’enzyme de type ligase. On porte le tout à 38°C et on laisse incuber. Si la recombinaison fonctionne, le plasmide aura été modifié et le gène T sera inactif car non continu. Les bactéries transformées par ce plasmide recombiné seront résistantes à l’ampicilline mais pas à la tétracycline.

Si la recombinaison ne fonctionne pas le gène T restera continu et sera fonctionnel : le plasmide n’aura pas été modifié. Des bactéries ayant été transformées par ce plasmide seront résistantes aux deux antibiotiques.

Il peut apparaître dans le milieu des gènes de proinsuline circularisés qui ne pourront pas transformer une bactérie.  

Pour obtenir des bactéries recombinées, on utilise la capacité de transformation des bactéries. Pour cela, il suffit d’introduire le contenu du tube de recombinaison dans un milieu de culture liquide contenant une souche bactérienne Escherichia coli sensible aux 2 antibiotiques. Ainsi au sein de cette population bactérienne, des bactéries vont intégrer un des 2 types de plasmides obtenus.

Les gènes de résistance sont donc pratiques car ils vont permettre la sélection des bactéries ayant récupéré le gène de la proinsuline. En effet, il est matériellement impossible de « voir » le gène et donc de sélectionner les plasmides qui ont bien été recombinés. C’est donc l’absence ou la présence de bactéries face aux antibiotiques qui nous permettra de déduire la présence de tel ou tel plasmide.

Les bactéries étaient initialement sensibles aux deux antibiotiques mais elles ont été transformées par l’un des deux plasmides : elles sont donc au moins résistantes à l’ampicilline car les 2 plasmides possède le gène A fonctionnel. En cultivant ces bactéries soumises aux différents plasmides sur un milieu contenant de l’ampicilline, les bactéries non transformées vont être éliminées. 

On aura donc récupéré uniquement des bactéries transformées. Il conviendra alors d’isoler les bactéries transformées par le plasmide recombiné, c'est-à-dire d’isoler les bactéries résistantes à l’ampicilline mais sensibles à la tétracycline.

Ainsi sur un milieu de culture contenant les 2 antibiotiques, seules les bactéries ayant reçu le plasmide non recombiné survivront. Celles ayant reçu le plasmide recombiné mourront. On peut alors se demander comment les récupérer si elles sont lysées par l’antibiotique. 

La technique est simple : à partir de la culture sur milieu enrichi en ampicilline, il convient de faire à l’aide d’un tampon, une empreinte de cette culture et de la déposer sur le milieu contenant les 2 antibiotiques. La comparaison des résultats obtenus permettra d’identifier dans la première culture, les colonies de bactéries transformées par le plasmide recombinés : ce seront les colonies qui resteront présentes sur le milieu enrichi en ampicilline mais ayant disparu sur le milieu contenant les 2 antibiotiques.

Il suffira ensuite de prélever ces colonies sur le milieu 1 et de les cultiver sur un milieu gélosé nutritif complet pour pouvoir récupérer ensuite le précurseur d’insuline.  

Pour ce faire, il suffira de lyser les bactéries productrices pour libérer le précurseur d’insuline.

En effet celui-ci se trouve dans le cytoplasme des bactéries et ces dernières ne l’excrètent pas dans le milieu. Cependant c’est un précurseur qui est produit et non de l’insuline. Il faut donc lui faire subir une action enzymatique pour le transformer en insuline injectable. Ainsi dans un contenant de laboratoire, le précurseur de proinsuline constitué de 86 acides aminés est soumis à l’action de différentes enzymes. On obtient de l’insuline mature (51 acides aminés), un peptide C (31 acides aminés) et 4 acides aminés libres. Or l’objectif est de récupérer une solution d’insuline pure, il va donc falloir la séparer des autres produits issus des réactions enzymatiques.

On utilise un procédé de séparation très simple : la chromatographie par gel-filtration. Dans une colonne de filtration, on dispose des billes de gel possédant des pores de diamètre sélectionné. Lors de la filtration, les molécules dont le volume correspond aux pores seront piégées par les billes et les molécules plus grosses circuleront dans la colonne et seront récupérables dans le filtrat. On parle de filtration par exclusion.  

Ici on cherche à éliminer les petites molécules à savoir le peptide C et les acides aminées afin de récupérer l’insuline. Il va donc falloir procéder à 2 filtrations consécutives : une pour éliminer les acides aminées libres et une pour éliminer le peptide C.

Ce sont principalement les rétrovirus qui sont utilisés comme vecteur en thérapie génique car ils permettent d'insérer la nouvelle information génétique dans le génome de la cellule cible.

Si la plupart des essais cliniques ont été réalisés avec des vecteurs dérivés de rétrovirus de souris, certains essais cliniques sont actuellement en cours utilisant des vecteurs dérivés du virus VIH.